Проект: Разработка экспериментальной установки синтеза пористых мембран для задач генетических технологий

В ходе выполнения проекта будет разработана установка для электрохимического синтеза мембран на основе пористого анодированного оксида алюминия (ПАОА) и кремния (ПАОК). Установка будет обеспечивать поддержание температурного режима, установку и поддержание электрических параметров (силы тока, напряжения). Установка будет состоять из ванны для анодирования с внешним размещением подложек, источника питания, охладителя. Будут подобраны режимы синтеза мембран с требуемыми характеристиками (геометрические размеры, межпоровое расстояние, диаметр пор, плотность функциональных групп). В случае с ПАОК также будет исследован режим фотоэлектрохимического синтеза, т.е. режим, при котором световое воздействие будет приводить к генерации носителей зарядов в полупроводниковом материале и вызывать в засвеченных участках ускоренный рост оксида. Значительные отличия в скорости роста засвеченных и незасвеченных участков позволяют реализовать обратную связь, позволяющую при помощи изменения интенсивности света регулировать скорость роста пленки. Отметим, что в настоящее время максимальная толщина пористых мембран, полученных электрохимическим способом, ограничена размером 250–300 мкм. Помимо самой установки для синтеза, также будут разработаны вспомогательные оснастки и подобраны режимы стравливания непрореагировавшего материала (алюминия, кремния), стравливания барьерного слоя, а также растравливания пор. В случае ПАОА будут подобраны режимы отжига с целью перевода кристаллической фазы из аморфного состояния, в котором материал получается в ходе электрохимического синтеза, в наиболее устойчивую и химически инертную альфа-фазу (корунд). Созданные подложки ПАОА и ПАОК будут функционализированы для обеспечения протекания твердофазного олигонуклеотидного синтеза внутри пор.

С развитием генетических технологий появилась потребность в массовом параллельном синтезе олигонуклеотидов. Однако западные компании, владеющие такими технологиями, не допускают поставок оборудования не только в другие страны, но даже внутри своей страны, поскольку такие технологии могут применяться для создания биологического оружия. Для предотвращения технологического отставания и противодействия внешним угрозам (в т.ч. биологическому терроризму) стоит острая необходимость в развитии технологии массового параллельного синтеза олигонуклеотидов. В ходе выполнения проекта ФНТП было показано, что наиболее оптимальным вариантом развития данной технологии является адаптация классического олигосинтеза, поскольку в этом случае имеется вся реагентная база, доступная в нашей стране. Однако для обеспечения высокой чистоты получаемой продукции синтез олигонуклеотидов необходимо выполнять в пористых материалах, с вертикальным расположением пор. Таким требованиям отвечают мембраны на основе пористых анодированных оксидов алюминия и кремния. Проект направлен на разработку установки для создания пористых мембран на основе анодированного оксида алюминия (ПАОА) и кремния (ПАОК), которые будут применяться в генетических технологиях. Такие мембраны могут использоваться в качестве подложек для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов – небольших (50–150 оснований) одноцепочечных фрагментов ДНК, необходимых для проведения различных генетических исследований, таких как секвенирование нового поколения (NGS), ДНК-чипы для анализа транскриптомов, синтез генов, лекарства на основе олигонуклеотидов и др. Кроме того, сами по себе пористые мембраны могут быть использованы в качестве газовых, либо жидкостных фильтров с размером пор от единиц до сотен нанометров (в зависимости от режимов синтеза), поскольку позволяют путем простого фильтрования воздуха, либо жидкостей выделять вирусы, бактерии и клетки. При пропитывании жидкостями мембрана становится прозрачной и пригодной для проведения исследований с использованием оптических микроскопов, поэтому отфильтрованные объекты могут сразу исследоваться методами оптической микроскопии. В силу технологического отставания системы массового параллельного синтеза олигонуклеотидов в России не применялись, соответственно не использовались и пористые мембраны для синтеза олигонуклеотидов. В настоящее время востребованность в таких технологиях огромна.

В ходе реализации проекта будет разработана установка для электрохимического синтеза мембран на основе пористого анодированного оксида алюминия (ПАОА) и кремния (ПАОК). Будут оптимизированы режимы анодирования, а также процессов травления и температурного отжига для создания мембран с требуемыми характеристиками.

Проектирование установки будет выполняться в САПР SolidWorks с последующим изготовлением деталей методом 3D печати. Режимы анодирования и последующих операций травления будут подбираться на основе контроля создаваемых материалов методами растровой электронной микроскопии. Будут получены экспериментальные зависимости характеристик мембран (толщина, размер пор и степень их однородности, межпоровое расстояние) от применяемых операционных режимов. Режимы отжига будут оптимизироваться на основе фазового состава мембран, полученного из рентгенофазового анализа. Функционализация поверхности пор будет выполняться методами химического прививания производными алкоксисиланов. Концентрация функциональных групп будет определяться методами оптической спектроскопии по калибровочным зависимостям. Созданные мембраны будут проверены на пригодность их использования в качестве подложек для синтеза коротких одноцепочечных фрагментов ДНК на разработанной в ТУСУРе системе автоматического синтеза олигонуклеотидов.

Мембраны на основе пористого анодированного оксида алюминия с упорядоченным расположением пор получили массовое распространение с 1995 года после работ H. Masuda (Япония) по росту мембран с упорядоченным расположением пор. В 2001 году было показано, что проточные ДНК-чипы на основе ПАОА проявляют высокую скорость гибридизации. Однако такие ДНК-чипы создавались методом прививания уже готовых олигонуклеотидов к поверхности ПАОА. Работ, в которых ПАОА выступал бы в качестве подложек для синтеза массивов олигонуклеотидов, нет. По-видимому, это связано с тем, что классические синтезаторы не предназначены для работы с таким материалом, а существующие устройства для массового параллельного синтеза олигонуклеотидов ограничены для продажи и многие исследования с их использованием не публикуются. К тому же, известно, что компании-производители ДНК-чипов используют в качестве подложек предметные стекла (Agilent), либо оксидированный кремний (Affymetrix), а для выполнения синтеза используют специально разработанные протоколы синтеза на поверхности этих материалов. Работ по применению пористого анодированного оксида кремния для синтеза ДНК также нет, хотя известно, что стекло, в том числе кварцевое, в виде мелких гранул хорошо функционализируется и применяется для синтеза олигонуклеотидов. По всей видимости, отсутствие упоминаний ПАОК для синтеза ДНК связано с теми же причинами, что и в случае с ПАОА. Кроме того, помимо высокой совместимости с существующими протоколами синтеза, интерес к ПАОК связан с тем, что оксид кремния имеет более низкий коэффициент преломления (n), чем ПАОА, поэтому некоторые жидкости (с несколько большим n) при заполнении пор ПАОК будут формировать вертикальные волноводы. Это означает, что при вертикальной точечной засветке свет будет распространяться вдоль такого волновода с низким светорассеянием. Это открывает широкие возможности для синтеза олигонуклеотидов фотоактивационным методом (реакция проходит только в засвеченных участках). Таким образом, мембраны на основе пористых анодированных оксидов алюминия и кремния представляются перспективными материалами, а их синтез является актуальным.

В рамках реализации проекта ФНТП «Разработка технологии субмикролитрового дозирования жидкостей для задач инженерной биологии, создание и практическая апробация опытного образца системы автоматического синтеза олигонуклеотидов на ее основе» в качестве материалов подложек для выполнения синтеза были предложены различные материалы (органические полимеры на основе сверхвысокомолекулярного полиэтилена, полистирола, фенолформальдегидных и эпоксидных смол, кремний и ПАОА). В ходе испытаний было установлено, что из предложенного ряда материалов пористый анодированный оксид алюминия дает наилучшие результаты и позволяет осуществлять рост олигонуклеотидов с использованием стандартных протоколов синтеза. Кроме того, его пористая структура позволяет выполнять смыв реагентов сквозь мембрану, тем самым минимизируя риск взаимного загрязнения рядом расположенных спотов в ходе операций промывок. Таким образом появилась необходимость в получении большого количества пористых подложек. Кроме того, заявители имеют опыт работы с подложками ПАОА и изучении оптических и лазерно-генерационных свойств элементов на основе этого материала [V.V. Shelkovnikov, G.A. Lyubas, S.V. Korotaev, T.N. Kopylova, E.N. Tel’minov, R.M. Gadirov, E.N. Nikonova, S.Yu. Nikonov, T.A. Solodova, V.A. Novikov Lasing of a Solid-State Active Element Based on Anodized Aluminum Oxide Film Doped with Rhodamine 6G // Russian Physics Journal. – 2017. – V.59. – N.12. – P.1-7].

В настоящее время на рынке доступны мембраны на основе пористого анодированного оксида алюминия. Основным производителем таких мембран является немецкая компания Cytiva, производящая фильтры Watman Anodisc с линейкой продукции, состоящей из трех размеров мембран и трех диаметров пор. Полным аналогом Watman Anodisc являются мембраны компаний Sterlitech Corporation (США) и Membrane Solutions (США), специализирующейся в области производства фильтрующего оборудования и пористых материалов. Недостатком всех этих мембран является низкая упорядоченность пор, поскольку все они получаются одностадийным анодированием. Еще одним недостатком мембран такого типа является высокая стоимость: порядка 2 100 рублей за диск диаметром 20 мм и толщиной 60 мкм. Кроме того, в настоящее время их поставки запрещены на территорию РФ. Также отметим, что коммерчески доступных установок для производства мембран на основе анодированных оксидов алюминия и кремния не обнаружено.